Manual de laboratorio de técnicas moleculares aplicadas a la microbiología agrícola y ambiental

Presentación 8
Introducción 13

Sección I Aislamiento de microorganismos y virus 14
Práctica de Laboratorio 1 Aislamiento de hongos y oomycetes 18
Experimento 1 Aislamiento a partir de sustratos ambientales 21
Experimento 2 Aislamiento a partir de tejido vegetal con síntomas de origen micótico 23
Experimento 3 Aislamiento a partir de sustratos orgánicos con presencia de mohos 26
Experimento 4 Aislamiento de levaduras 27
Práctica de Laboratorio 2 Aislamiento de bacterias 29
Experimento 5 Aislamiento a partir de sustratos ambientales 31
Experimento 6 Aislamiento a partir de tejido vegetal con síntomas de origen bacteriano 33
Práctica de Laboratorio 3 Aislamiento y/o enriquecimiento de virus 36
Experimento 7 Aislamiento de fagos a partir de sustratos ambientales 41
Experimento 8 Transmisión mecánica de virus de plantas para su mantenimiento in vivo 42
Experimento 9 VANA (Virion-Associated Nucleic Acids purified from viral particles) para virus de plantas 44
Experimento 10 VANA (Virion-Associated Nucleic Acids purified from viral particles) para virus presentes en aguas residuales 46
Experimento 11 Precipitación con PEG para alimentos presumiblemente contaminados con norovirus HVA y otros virus 47

Sección II Identificación y caracterización molecular de microorganismos y virus 49
Práctica de Laboratorio 4 Extracción de ácidos nucleicos (DNA RNA dsRNA) y proteínas 52
Experimento 12 Extracción de DNA a partir de cultivos bacterianos Método del SDS 55
Experimento 13 Extracción de DNA a partir de aislamientos de hongos Método del CTAB 56
Experimento 14 Extracción convencional de DNA a partir de tejido foliar de plantas o alimentos para detección molecular de patógenos Método del CTAB 58
Experimento 15 Extracción de DNA de tejido foliar de plantas o alimentos para detección molecular de patógenos utilizando kit comercial 60
Experimento 16 Extracción de DNA a partir de suelos lodos y otros sustratos ambientales con kit comercial 62
Experimento 17 Extracción de RNA en tejido foliar de plantas para detección de virus viroides o transcritos de fitopatógenos celulares por el método TRIzol 64
Experimento 18 Extracción de RNA con kit en tejido foliar de plantas VANA o de los extractos precipitados con PEG para detección de virus viroides o transcritos de patógenos celulares 66
Experimento 19 Extracción de dsRNA en tejido foliar de plantas para detección de virus 69
Experimento 20 Extracción de proteínas totales por el método del fenol de tejido foliar de plantas o inducidas en bacterias transformadas 71
Experimento 21 Extracción de proteínas totales de tejido foliar de plantas o inducidas en bacterias transformadas por el método del TCA 73
Experimento 22 Evaluación de actividad antimicrobiana de extractos de proteínas 75

Práctica de Laboratorio 5 Cuantificación separación por electroforesis y análisis cualitativo de ácidos nucleicos 78
Experimento 23 Cuantificación de DNA y RNA utilizando NanoDrop 82
Experimento 24 Limpieza de extractos de AN luego de lecturas deficientes en Nanodrop o en espectrofotómetro 83
Experimento 25 Determinación de la concentración y valor RIN utilizando un Bioanalyzer 6000 85
Experimento 26 Electroforesis en gel de agarosa 87
Experimento 27 Purificación de fragmentos separados en gel de agarosa utilizando Kit comercial 89
Experimento 28 Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de ácidos nucleicos 91
Experimento 29 Electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas (SDS-PAGE) 94

Práctica de Laboratorio 6 Amplificación de ácidos nucleicos 100
Experimento 30 Amplificación por PCR de regiones diagnósticas para identificación de hongos y bacterias 105
Experimento 31 Amplificación por PCR de regiones aleatorias repetitivas o para evaluación de variabilidad intraespecífica de hongos y bacterias 110
Experimento 32 RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism) de productos amplificados por PCR 114
Experimento 33 PCR en tiempo real (qPCR) con SYBR Green 116
Experimento 34 PCR en tiempo real (qPCR) con sonda Taqman 121
Experimento 35 Síntesis de cDNA para amplificación posterior por PCR 124
Experimento 36 One-step RT-PCR 127
Experimento 37 Amplificación por circulo rodante (RCA) 129

Práctica de Laboratorio 7 Clonación en plásmidos 131
Experimento 38 Preparación de medios de cultivos para clonación 135
Experimento 39 Ligación con el kit CloneJET PCR Cloning 136
Experimento 40 Transformación 137
Experimento 41 Confirmación de colonias recombinantes por "Colony PCR" y RFLP 139
Experimento 42 Purificación de plásmidos 142
Experimento 43 Transcripción in vitro 143

Sección III Caracterización fenotípica de microorganismos y virus 147
Práctica de Laboratorio 8 Identificación fenotípica de hongos y oomycetes 150
Experimento 44 Observación de estructuras microscópicas de hongos y oomycetes 152

Práctica de Laboratorio 9 Identificación fenotípica de bacterias 156
Experimento 45 Evaluación fenotípica de bacterias 159

Práctica de Laboratorio 10 Detección serológica y microscópica de virus 166
Experimento 46 Prueba serológica ACP-ELISA 165
Experimento 47 Prueba serológica DAS-ELISA 168
Experimento 48 Inmunocaptura para RT-PCR (IC-RT-PCR) 170
Experimento 49 Observación de partículas virales al microscopio electrónico de transmisión (TEM) 171